慢病毒服務(wù)簡介:

慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的兒率大大增加，能夠比較方便快捷地實現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長期、穩(wěn)定表達(dá)。

慢病毒(Lentivirus) 載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷Ⅰ型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。所以，在體外實驗及體內(nèi)實驗的研究中，慢病毒己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一， 并且正在獲得越來越廣泛的應(yīng)用。

服務(wù)價格及周期:

編號	表達(dá)基因或shRNA	滴度	價格	周期
MBD-001	表達(dá)基因（<2K）	1×108?TU	3000元	3~4周
MBD-002		2×108?TU	4500元	3~4周
MBD-003		其他	詢價	3~4周
MBD-004	表達(dá)基因（2K~3K）	1×108?TU	4000元	3~4周
MBD-005		2×108?TU	6000元	3~4周
MBD-006		其他	詢價	3~4周
MBD-007	表達(dá)shRNA（單條）	1×108?TU	3000元	3~4周
MBD-008		2×108?TU	4500元	3~4周
MBD-009		更高滴度	詢價	3~4周
MBD-010	表達(dá)shRNA（三條，保證至少一條有效）	1×108?TU	10000元	3~4周
MBD-011		更高滴度	詢價	3~4周

備注：以上價格僅僅是病毒包裝的價格，不包含基因和載體構(gòu)建的費(fèi)用。

慢病毒對照價格及周期:

編號	服務(wù)內(nèi)容	滴度	服務(wù)價格(元)	服務(wù)周期
MBD-012	綠色熒光；表達(dá)基因用對照	l x108TU	1500	現(xiàn)貨
MBD-013		2×108TU	2500	現(xiàn)貨
MBD-014		更高滴度	詢價	2-3周
MBD-015	紅色熒光；表達(dá)基因用對照	l x108TU	1500	現(xiàn)貨
MBD-016		2×108TU	2500	現(xiàn)貨
MBD-017		更高滴度	詢價	2-3 周
MBD-018	綠色熒光；表達(dá)shRNA用對照	l x108TU	1500	現(xiàn)貨
MBD-019		2×108TU	2500	現(xiàn)貨
MBD-020		更高滴度	詢價	2-3周

慢病毒包裝系統(tǒng)組成:

慢病毒包裝系統(tǒng)一般由慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝載體組成。慢病毒表達(dá)載體，即通常所說的穿梭載體，包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。而慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝， 包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染?，F(xiàn)在的慢病毒包裝系統(tǒng)一般都是三質(zhì)?；蛩馁|(zhì)粒包裝系統(tǒng)。其中四質(zhì)粒系統(tǒng)比三質(zhì)粒系統(tǒng)在生物安全性上更好一些，所以應(yīng)用較多。

慢病毒包裝系統(tǒng)載體選擇:

目前市面上常見的商業(yè)化慢病毒包裝系統(tǒng)較多，其中常用的有Clontech 、Invitrogen 等公司的相關(guān)產(chǎn)品。本公司通過大量實驗摸索，博采眾家之長，建立起了一套穩(wěn)定、可靠、高效的慢病毒包裝系統(tǒng)。這套慢病毒包裝系統(tǒng)， 其穿梭載體主要來自Clontech公司，包括以下載體：

載體名稱	出品公司	用途	啟動子	熒光標(biāo)記	真核篩選標(biāo)記
pLVX-DsRed-Monomer-Nl	Clontech	表達(dá)基因	CMV	紅色熒光	Puro
pLVX-AcGFPI-N1	Clontech	表達(dá)基因	CMV	綠色熒光	Puro
pLVX-IRES-tdTomato	Clontech	表達(dá)基因	CMV	紅色熒光	無
pLVX-lRES-ZsGreen1	Clontech	表達(dá)基因	CMV	綠色熒光	無
pLVX-lRES-Neo	Clontech	表達(dá)基因	CMV	無	Neo
pLVX-lRES-puro	Clontech	表達(dá)基因	CMV	無	Puro
pLVX-shRNA1	Clontech	表達(dá)shRNA	hU6	無	Puro
pLVX-shRNA2	Clontech	表達(dá)shRNA	hU6	綠色熒光	無

轉(zhuǎn)染了紅色熒光蛋白載體或綠色熒光蛋白載體24小時后的病毒包裝293-t細(xì)胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果：

您可以根據(jù)需要，選用合適的穿梭載體來裝載目的基因或者目的shRNA。在實際使用過程中，我們采用Clontech配套的慢病毒包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2.G(或Invitrogen公司的pLPl 、pLP2 、pLP/VSVG質(zhì)粒）。

客戶須知:

1. 上述價格均不包括運(yùn)輸費(fèi)用。如果您需要干冰運(yùn)輸，按照30元/公斤干冰計算，一般需要加10公斤干冰，即干冰運(yùn)輸費(fèi)用在300元左右。如果采用超低溫冰袋運(yùn)輸，則運(yùn)輸費(fèi)用由AXYBIO公司承擔(dān)。我們將采用順豐快遞寄送，全國大部分城市隔天到貨。
2. 如客戶所需包裝的目的基因由客戶提供，則客戶應(yīng)提供所要構(gòu)建慢病毒的目的基因的序列及其它相關(guān)說明信息（例如裝載載體、質(zhì)粒圖譜、酶切位點等）?？蛻魬?yīng)對所提供的材料及信息負(fù)責(zé)，如因客戶提供的材料及信息不準(zhǔn)確而引起的實驗延誤或經(jīng)濟(jì)損失由客戶承擔(dān)。
3. 如客戶訂購基因過表達(dá)的慢病毒，我們承諾交付的慢病毒的滴度不低于10⁷TU/ml，如果低于此滴度，我們將免費(fèi)重新提供。如果重新提供的病毒還是達(dá)不到要求，我們將做退單處理，客戶不需支付任何費(fèi)用。我們會盡量提供高滴度的慢病毒產(chǎn)品，但考慮到慢病毒包裝對外源表達(dá)框的限制，外源表達(dá)框較大時，病毒滴度會受到較大影響，因此，如病毒出毒實際滴度介于10⁷TU/ml和10⁸TU/ml之間，我們將按實際滴度出貨。表達(dá)shRNA的慢病毒，出毒滴度一般都可以達(dá)到10⁸TU/ml。
4. 如果shRNA序列由客戶提供，則本公司只負(fù)責(zé)證明包含有該shRNA序列的慢病毒構(gòu)建成功，而不對其干擾效率做任何保證。
5. 如客戶需委托本公司使用包裝好的慢病毒感染目的細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)目的基因或目的shRNA的細(xì)胞系，則相關(guān)實驗費(fèi)用另外計算。

附：慢病毒包裝和滴度測定流程

1 表達(dá)基因用慢病毒包裝載體準(zhǔn)備:

編號	服務(wù)描述	服務(wù)周期
1	客戶選擇目的基因、穿梭載體，AXYBIO公司負(fù)責(zé)實驗設(shè)計	1 – 2 周
2	客戶提供目的基因，或從AXYBIO cDNA庫中購買該基因	1周
3	將目的基因的CDS 區(qū)構(gòu)建至穿梭載體上	2 – 3 周

2 表達(dá)shRNA 用慢病毒包裝載體準(zhǔn)備:

編號	服務(wù)描述	服務(wù)周期
1	客戶選擇靶基因或目的shRNA、穿梭載體， AXYBIO公司負(fù)責(zé)實驗設(shè)計	1 – 2 周
2	將目的shRNA 構(gòu)建至穿梭載體上	2 – 3 周
3	有效shRNA 篩選(三條shRNA，保證至少一條shRNA干擾效率在70%以上)	3 – 4 周

3 質(zhì)粒準(zhǔn)備和轉(zhuǎn)染

將3或4種質(zhì)粒混合于15 ml滅菌管中，采用Opti-MEM和Lipo2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參考Lipo2000標(biāo)準(zhǔn)PROTOCOL和本公司的實際經(jīng)驗。

4 收集第一輪的培養(yǎng)基上清

（1）轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞CO₂培養(yǎng)箱48 h，37℃，收集上清。
（2）收集的上清，4℃ 8000g離心10 min，除去細(xì)胞碎片，0.45 μm PVDF膜過濾。
（3）所得病毒液一部分用于測定病毒滴度，其余可凍存于-80℃。
（4）加入10ml新鮮的DMEM+2%NBS培養(yǎng)基。

5 收集第二輪的培養(yǎng)基上清

（1）加入新鮮培養(yǎng)基后，培養(yǎng)24小時。
（2）收集的上清，4℃ 8000g離心10 min，除去細(xì)胞碎片，0.45 μm PVDF膜過濾。
（3）所得病毒液一部分用于測定病毒滴度，其余可凍存于-80℃。

6 病毒的濃縮：離心方法采用差速離心法

（1）病毒上清經(jīng)0.45 μm濾膜處理，于4℃ 10,000g離心15 min。
（2）上清轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中，濾液在4℃，40,000g離心2 h。
（3）離心管置于冰浴條件下，用1%體積的DMEM+10% NBS重懸沉淀，重懸時使用同一吸管以避免損失，約每15 s吹打1次，避免產(chǎn)生氣泡。

7 測定病毒滴度（熒光顯微鏡計數(shù)）

（1）滴度測定前，以0.5×10⁵濃度種細(xì)胞293T于24孔板，每孔1 ml細(xì)胞培養(yǎng)基，過夜（12 h）培養(yǎng)使細(xì)胞在板底部形成單層，此時細(xì)胞密度大約為1.0×10⁵。
（2）取10 μl病毒液+90 μl培養(yǎng)基，依次稀釋得到10^-1至10^-8病毒稀釋液。24孔板依次加入梯度稀釋的待測病毒樣品20 μl，留一孔作為對照不加病毒，培養(yǎng)2天。
（3）熒光計數(shù)：熒光顯微鏡下計數(shù)帶有熒光的細(xì)胞數(shù)目
（4）計算病毒滴度：熒光細(xì)胞數(shù)目×稀釋倍數(shù)（10、10²…10⁸）/接種病毒