服務(wù)價(jià)格及周期:
服務(wù)編號(hào) | 服務(wù)內(nèi)容 | 價(jià)格 | 服務(wù)周期 |
MRNA-1 | 靶基因3′-UTR雙熒光素酶野生型載體(?1.5kb) | 1500元 | 1-2周 |
MRNA-2 | 靶基因3′-UTR雙熒光素酶突變型載體(一個(gè)位點(diǎn)) | 900元 | 1-2周 |
MRNA-3 | 質(zhì)粒提?。▋蓚€(gè)靶基因加一個(gè)對(duì)照質(zhì)粒) | 900元 | 1-2周 |
MRNA-4 | miRNA表達(dá)載體或mimic與雙熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染(96孔板),雙熒光素酶檢測(cè) | 5000元 | 1-2周 |
microRNA靶基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)概述
當(dāng)前,microRNA對(duì)靶基因的功能研究十分熱門。利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)尋找或驗(yàn)證microRNA對(duì)靶點(diǎn)作用性是不可或缺的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本公司可為您提供microRNA報(bào)告基因載體構(gòu)建服務(wù),并可進(jìn)一步為您提供熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)服務(wù)。您只需要提供目的microRNA靶位點(diǎn)序列,我們專業(yè)的技術(shù)服務(wù)人員就可替您完成載體構(gòu)建,為您節(jié)省大量的時(shí)間和精力。
下圖為microRNA-reporter載體表達(dá)框架示意圖,具有多克隆位點(diǎn),方便插入目的靶點(diǎn)序列。psiCHECK-2載體用于終點(diǎn)法的細(xì)胞裂解物檢測(cè),包含螢火蟲熒光素酶基因,使海腎熒光素酶的表達(dá)水平歸一化,令該系統(tǒng)更可靠、重現(xiàn)性更好。使用psiCHECK-2載體時(shí),由于是一個(gè)載體,無須通過共轉(zhuǎn)染進(jìn)行歸一化。
microRNA報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)流程:
1.microRNA靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)
利用Targetscan,miRanda,PicTar軟件得到目的microRNA的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)序列。
2.獲得microRNA靶點(diǎn)序列
根據(jù)提供的靶序列,合成兩條互補(bǔ)的單鏈DNA模板。或者,設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增目的microRNA靶基因3’UTR序列,或直接合成。
3.microRNA靶序列克隆
將合成的兩條單鏈退火成雙鏈(具有粘性末端),或?qū)CR產(chǎn)物雙酶切,后連入經(jīng)過同樣雙酶切的miR-reporter載體中,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
4.陽性克隆鑒定
挑選轉(zhuǎn)化的菌落,PCR篩選含有插入片段的陽性克隆,測(cè)序驗(yàn)證克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備
將含目的microRNA靶基因的報(bào)告基因載體、內(nèi)參質(zhì)粒和microRNA mimics或microRNA negative control共轉(zhuǎn)染293T或Hela細(xì)胞。
6.熒光素酶檢測(cè)
共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24-72h后,進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè),確定目的microRNA的靶基因。
整理分析數(shù)據(jù),得出結(jié)論:
提供有microRNA靶序列的報(bào)告質(zhì)粒,以及內(nèi)參和對(duì)照質(zhì)粒各一份。
甘油保存菌株各一支。
附mir-reporter載體的說明書
以及實(shí)驗(yàn)報(bào)告:
包括載體構(gòu)建過程,鑒定記錄,測(cè)序報(bào)告,細(xì)胞轉(zhuǎn)染,熒光檢測(cè)。