貨號(hào)：A101-5
規(guī)格：500rxn（1.0 ml×5支）
保存：-20℃避光保存兩年
【產(chǎn)品概述】
本產(chǎn)品是使用SYBR GreenI 嵌合熒光法進(jìn)行qPCR的專用試劑。核心組分（包含熱啟動(dòng)Taq酶，UDG酶， dNTPs， dUTP， Mg2+， SYBRGreenI等）是基于化學(xué)法修飾的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，配合針對(duì)qPCR優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，可以有效抑制非特異性擴(kuò)增，顯著提高擴(kuò)增效率，從而對(duì)靶基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量。同時(shí)，本產(chǎn)品使用UDG酶和dUTP有效防止PCR產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。本產(chǎn)品為2×預(yù)混試劑，使用時(shí)只需加入模板、引物、ROX? Reference Dye（根據(jù)qPCR儀選擇）和水，使其工作濃度為1×，即可進(jìn)行反應(yīng)。
本品特點(diǎn)：使用化學(xué)法修飾的熱啟動(dòng)酶，提高靈敏度，增強(qiáng)特異性；使用dUTP和UDG酶，可有效排除先前擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確；針對(duì)qPCR優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，增強(qiáng)特異性，減少引物二聚體形成，提高擴(kuò)增效率，重復(fù)性好，可信度高；本品不含有用以校準(zhǔn)孔間熒光信號(hào)差異的ROX Reference Dye，適用于Bio-Rad iCycler CFX96，CFX384，iQ，iQ5，MyiQ，Opticon, Opticon 2，MiniOpticon，Chromo4，Qiagen Corbett Rotor-Gene Q，Rotor-Gene 3000，Rotor-Gene 6000，Eppendorf Mastercycler ep realplex， realplex 2s，Roche Applied Science LightCycler 480，Thermo Scientific PikoReal Cycler，Illumina Eco qPCR，Cepheid SmartCycler，Takara TP-800等機(jī)型。
【推薦qPCR反應(yīng)體系（以20 μl體系為例）】

反應(yīng)體系中各成分的量可根據(jù)以下原則進(jìn)行調(diào)整：
反應(yīng)體系中引物終濃度為0.2μM即可得到較好的擴(kuò)增效果。當(dāng)反應(yīng)性能較差時(shí)，引物終濃度可以在0.1 -0.5 μM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整；qPCR靈敏度極高，建立反應(yīng)體系時(shí)加入模板量的準(zhǔn)確度對(duì)最終結(jié)果會(huì)有很大的影響。推薦將模板稀釋后加入反應(yīng)體系中，這樣可以有效提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性；如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過qPCR反應(yīng)總體積的1/10。
【PCR反應(yīng)條件】

【注意事項(xiàng)】

• 本品盡量避免反復(fù)凍融，以免酶活下降。如每次使用量較少，推薦分裝后保存
• 使用前請(qǐng)上下顛倒混勻預(yù)混液，預(yù)混液經(jīng)混勻瞬時(shí)離心后即可使用
• 2×SYBR qPCR Master Mix于-20℃保存時(shí)，有時(shí)會(huì)形成沉淀。在室溫短時(shí)間放置后，渦旋混勻即可完全溶解。確保試劑混合均勻后再使用
• 本品含有熒光染料SYBR GreenI，保存以及配制反應(yīng)體系時(shí)應(yīng)盡量避免強(qiáng)光照射
• 由于本品檢測(cè)靈敏度極高，在配制過程中請(qǐng)使用干凈滅菌槍頭、反應(yīng)管，條件容許的實(shí)驗(yàn)室推薦使用專用的移液器，避免污染

【常見問題與解決方案】
1、陰性對(duì)照中有信號(hào)產(chǎn)生：
a) 模板或試劑被核酸污染：在進(jìn)行PCR反應(yīng)前采取標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)防措施，以降低污染風(fēng)險(xiǎn)
b) 產(chǎn)生引物二聚體：配合融解曲線進(jìn)行分析
2、融解曲線出現(xiàn)多個(gè)峰：
a) 存在引物二聚體或其他特殊結(jié)構(gòu)：根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成新的引物
b) 引物濃度太高：適當(dāng)降低引物濃度
c) cDNA模板帶有基因組污染：重新制備cDNA模板
3、定量PCR無擴(kuò)增曲線：
a) 確認(rèn)程序中是否設(shè)置了信號(hào)采集步驟：兩步法擴(kuò)增程序?qū)⑿盘?hào)采集設(shè)置在退火延伸階段
b) 確認(rèn)引物是否降解：長(zhǎng)時(shí)間未使用的引物可能發(fā)生降解，合成新的引物，重復(fù)實(shí)驗(yàn)
c) 模板濃度太低或降解：減少稀釋度，一般未知濃度的樣品按最高濃度進(jìn)行檢測(cè)
4、定量PCR擴(kuò)增曲線不平滑：
a) 信號(hào)太弱：提高模板濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)
b) ROX類型使用錯(cuò)誤：確認(rèn)所用ROX與機(jī)型是否匹配
c) 定量PCR反應(yīng)過程中體積變化：PCR管未蓋嚴(yán)導(dǎo)致反應(yīng)體系蒸發(fā)
5、Ct值出現(xiàn)太晚：
a) 擴(kuò)增效率低：優(yōu)化反應(yīng)條件，或者重新設(shè)計(jì)合成引物
b) 模板濃度太低：減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品按最高濃度進(jìn)行檢測(cè)
c) 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)
d) PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)：推薦PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為90-200bp
【備注】
本產(chǎn)品僅供科研使用。在確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量出現(xiàn)問題時(shí)，本公司承諾為客戶免費(fèi)更換等量的合格產(chǎn)品。 在所有情況下，本公司對(duì)此產(chǎn)品所承擔(dān)的責(zé)任，僅限于此產(chǎn)品的價(jià)值本身。