貨號(hào)：A103-5

規(guī)格：500rxn（1.0 ml×5支）

保存：-20℃避光保存兩年

【產(chǎn)品概述】

本產(chǎn)品是采用探針?lè)ㄟM(jìn)行Real Time PCR（qPCR）檢測(cè)的試劑。核心組分是基于化學(xué)法修飾的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，配合針對(duì)qPCR優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PCR抑制物耐受性高、擴(kuò)增特異性高、擴(kuò)增效率高、檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn)。本產(chǎn)品是2×濃度的Premix型試劑，配制qPCR反應(yīng)體系十分簡(jiǎn)便。同時(shí)，本產(chǎn)品使用UDG酶和dUTP有效防止PCR產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。使用時(shí)只需加入模板、引物、探針和水，使其工作濃度為1×，即可進(jìn)行反應(yīng)。此外，本產(chǎn)品適用于快速PCR，可以在寬廣的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)對(duì)靶基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，檢測(cè)重復(fù)性好，可進(jìn)行可信度高的Real Time PCR分析。

本品特點(diǎn)：使用化學(xué)法修飾的熱啟動(dòng)酶，提高靈敏度，增強(qiáng)特異性；使用dUTP和UDG酶，可有效排除先前擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確；針對(duì)qPCR優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，增強(qiáng)特異性，減少引物二聚體形成，提高擴(kuò)增效率，重復(fù)性好，可信度高。

本品不含有用以校準(zhǔn)孔間熒光信號(hào)差異的ROX Reference Dye，適用于Bio-Rad iCycler CFX96，CFX384，iQ，iQ5，MyiQ，Opticon, Opticon 2，MiniOpticon，Chromo4，Qiagen Corbett Rotor-Gene Q，Rotor-Gene 3000，Rotor-Gene 6000，Eppendorf Mastercycler ep realplex， realplex 2s，Roche Applied Science LightCycler 480，Thermo Scientific PikoReal Cycler，Illumina Eco qPCR，Cepheid SmartCycler，Takara TP-800等機(jī)型。以下機(jī)型：Applied Biosystems 7000，7300，7700，7900，7900HT，7900HT Fast；StepOne，StepOnePlus等需要添加高濃度ROX Reference Dye。這些機(jī)型：Applied Biosystems 7500，7500 Fast，ViiA7；Stratagene MX3000P，MX3005P，MX4000等需要添加低濃度ROX Reference Dye。

【推薦qPCR反應(yīng)體系（以20 μl體系為例）】

Component	Volume	Final ?Concentration
2×qPCR Master Mix(Probe Method)	10 μl	1×
10 μM Forward Primer	0.4 μl	0.2 μM
10 μM Reverse Primer	0.4 μl	0.2 μM
10 μM Probe	0.4 μl	0.2 μM
PCR-grade Water	Variable	–
Template	Variable	As Required
Total Volume	20 μl	–

反應(yīng)體系中各成分的量可根據(jù)以下原則進(jìn)行調(diào)整：

反應(yīng)體系中引物終濃度為0.2μM即可得到較好的擴(kuò)增效果。當(dāng)反應(yīng)性能較差時(shí)，引物終濃度可以在0.1 -0.5 μM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整；qPCR靈敏度極高，建立反應(yīng)體系時(shí)加入模板量的準(zhǔn)確度對(duì)最終結(jié)果會(huì)有很大的影響。推薦將模板稀釋后加入反應(yīng)體系中，這樣可以有效提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性；如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過(guò)qPCR反應(yīng)總體積的1/10。

【PCR反應(yīng)條件】

Step	Temperature	Duration	Cycles
UDG pre-treatment	25℃	3 min	1
Enzyme activation	94℃	10 min	1
Initial Denaturation	94℃	3 min	1
Denaturation	94℃	10 sec	40-45
Annealing/Extensiona	60℃	30 sec

• 退火/延伸溫度根據(jù)不同的引物和探針需要進(jìn)行優(yōu)化，推薦優(yōu)化的溫度范圍為58℃-65℃。退火/延伸時(shí)間請(qǐng)根據(jù)您使用的Real-time PCR儀所需要的數(shù)據(jù)采集最短時(shí)間限制自行調(diào)整：使用ABI 7700和7900時(shí)至少30秒；使用ABI 7000、7300和 7500時(shí)34秒。

【注意事項(xiàng)】

• 盡量避免反復(fù)凍融，以免酶活下降。如每次使用量較少，推薦分裝后保存
• 使用前請(qǐng)上下顛倒混勻預(yù)混液，預(yù)混液經(jīng)混勻瞬時(shí)離心后即可使用
• qPCR Master Mix(Probe Method)于-20℃保存時(shí)，有時(shí)會(huì)形成沉淀。在室溫短時(shí)間放置后，渦旋混勻即可完全溶解。確保試劑混合均勻后再使用
• 由于本品檢測(cè)靈敏度極高，在配制過(guò)程中請(qǐng)使用干凈滅菌槍頭、反應(yīng)管，條件容許的實(shí)驗(yàn)室推薦使用專用的移液器，避免污染

【常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案】

1、陰性對(duì)照中有信號(hào)產(chǎn)生：

模板或試劑被核酸污染：在進(jìn)行PCR反應(yīng)前采取標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)防措施，以降低污染風(fēng)險(xiǎn)

2、定量PCR無(wú)擴(kuò)增曲線：

• 確認(rèn)程序中是否設(shè)置了信號(hào)采集步驟：兩步法擴(kuò)增程序?qū)⑿盘?hào)采集設(shè)置在退火延伸階段
• 確認(rèn)引物是否降解：長(zhǎng)時(shí)間未使用的引物可能發(fā)生降解，合成新的引物，重復(fù)實(shí)驗(yàn)
• 模板濃度太低或降解：減少稀釋度，一般未知濃度的樣品按最高濃度進(jìn)行檢測(cè)

3、定量PCR擴(kuò)增曲線不平滑：

• 信號(hào)太弱：提高探針濃度或者優(yōu)化探針濃度
• 定量PCR反應(yīng)過(guò)程中體積變化：PCR管未蓋嚴(yán)導(dǎo)致反應(yīng)體系蒸發(fā)

【備注】

本產(chǎn)品僅供科研使用。在確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，本公司承諾為客戶免費(fèi)更換等量的合格產(chǎn)品。 在所有情況下，本公司對(duì)此產(chǎn)品所承擔(dān)的責(zé)任，僅限于此產(chǎn)品的價(jià)值本身。